L'obiettivo principale è la realizzazione di colture di tessuti meristematici miste, nelle quali siano presenti tessuti appartenenti a donatori differenti di cui verranno studiate le interazioni molecolari all'interno di un modello in vitro.
Successivamente si studierà il comportamento dei tessuti nella loro crescita, differenziamento, specializzazione passando infine da un modello in vitro a un modello in vivo nel contesto del quale verranno studiate le interazione fra l'ambiente e il sistema biologico realizzato.
Ulteriore obiettivo della ricerca sarà definire gli indici di staminalità di meristemi periferici, volti a spiegare l'accrescimento e la proliferazione di germogli ascellari.
STRUMENTAZIONE UTILIZZATA
L'esperimento si svolgerà su meristemi prelevati da Pelargonium peltatum e da Pelargonium zonale nelle regioni centrali e periferiche. La sterilizzazione dei campioni vegetali sarà ottenuta mediante una successione di soluzioni sterilizzanti quali:
- soluzione 1:4 di etanolo
- soluzione 1:4 di ipoclorito di sodio
- acqua distillata sterile
La sterilità dell'ambiente è ottenuta mediante soluzioni alcoliche e idroalcoliche nebulizzate.
La sterilità della strumentazione, nel caso di strumenti in plastica o plexiglass, è ottenuta mediante un primo lavaggio con soluzioni alcoliche e una successiva esposizione ai raggi UV-C .
La sterilità della vetreria e della strumentazione in metallo è ottenuta mediante esposizione ad alte temperature (121°C a secco).
Il mezzo di coltura utilizzato è il Murashige-Skoog agar, arricchito con amoxicillina e acido clavulonico per garantire un'ulteriore difesa antibatterica.
PROCEDIMENTI
Prima fase: realizzazione di colture di tessuti meristematici pure.
Si prendano in esame i singoli donatori di tessuti meristematici Pelargonium peltatum e Pelargonium zonale. Vengono da essi prelevati tre tipologie di campioni:
- Meristemi centrali: meristemi apicali
- Meristemi centrali: meristemi ascellari
- Meristemi secondari: meristemi del fusto o del gambo quiescenti
I tessuti vengono prelevati e successivamente sterilizzati in successione mediante le seguenti soluzioni: soluzione alcolica, soluzione di ipoclorito di sodio e acqua distillata sterile. Vengono successivamente trasportati nell'apposito mezzo di coltura, mediante pinzette sterili. Si realizzano sei colture distinte di cui tre con tessuti prelevati da Pelargonium peltatum e tre prelevati da Pelargonium zonale. Si attende la crescita del callo meristematico secondo i tempi previsti da protocollo.
Seconda fase: isolamento del callo meristematico e realizzazione di colture di tessuti meristematici misti.
Lavorando in ambiente sterile, con pinzette sterili sono prelevati i calli meristematici, con forbici in metallo sterili vengono recisi i punti esterni in cui si hanno principi di differenziazione o di specializzazione tissutale (principi di foglie, principi di radici, principi di gemme). I tre calli meristematici originati da cellule di Pelargonium peltatum vengono opportunamente tritati separatamente. Si realizzano così delle poltiglie cellulari. Da ogni poltiglia cellulare viene prelevato un quarto in volume, che sarà utilizzato per l'esame istologico (esame istologico mediante blu di Metilene). Si procederà in egual modo per quanto riguarda i calli meristematici originati da cellule di Pelargonium zonale. Si nominano le varie poltiglie secondo la seguente nomenclatura:
- "A" - Poltiglia proveniente dal meristema centrale apicale
- "B" - Poltiglia proveniente dal meristema centrale ascellare
- "C" - Poltiglia proveniente dal meristema periferico del fusto del gambo
Si noti dunque che vengono denominati con la stessa lettera meristemi provenienti da donatori diversi ma da siti uguali. Vengono dunque mescolate le cellule dei gruppi A, le cellule dei gruppi B e le cellule dei gruppi C e poste in provetta con soluzione acquosa arricchita con auxina e chinetina per un'ora. Viene successivamente addizionato EDTA bisodico chelante del calcio per favorire la separazione fra le cellule meristematiche e dunque lo sfaldamento del tessuto solido.
Vengono prelevati i meristemi del gruppo A dalla provetta e inseriti in coltura utilizzando come mezzo di coltura Murashige-Skoog agar, arricchito con amoxicillina e acido clavulonico.
Si attende il tempo previsto da protocollo.
In una terza fase da stabilire secondo i risultati della seconda fase, saranno valutati gli sviluppi istologici dei nuovi meristemi misti, favorendo, da un punto di vista molecolare, lo sviluppo congiunto dei due tessuti e realizzando una mappatura dei marker citologici distintivi dei due meristemi (marker specie specifici). Verranno inoltre studiate le interazioni molecolari e la capacità di mantenere indici di staminalità del tessuto, grazie alla promiscuità citologica.
In una quarta fase sarà oggetto di studio il trasferimento del sistema da una situazione in vitro a una situazione in vivo, favorendo sviluppo, differenziazione e specializzazione congiunta dei meristemi di cui sopra, osservando in particolare la fotosensibilità del tessuto e i differenziamenti che ne conseguiranno.
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